Главная страница Карта сайта Контактная информация





     


Главная » О лаборатории » Группа мономолекулярной флюоресцентной спектроскопии »

Изучение одиночных нуклеосомных комплексов с помощью FRET

Молекула ДНК в клетках эукариот компактно упакована в структуры размером около 10 нм, называемые нуклеосомами. Хотя их пространственная  организация довольно хорошо изучена, структурные изменения, происходящие в нуклеосомах в процессе транскрипции с участием РНК-полимеразы и других белков требуют детального исследования. Одним из путей решения данной задачи является разработка и применение методов изучения процессов, происходящих на уровне одиночных нуклеосомных комплексов, с  временным разрешением. 

Нами  разработаны методики исследования иммобилизованных и свободно диффундирующих одиночных нуклеосом на основе флуоресцентной микроскопии и эффекта FRET (Фёрстеровского резонансного переноса энергии). Обе методики реализованы с применением  лазерного сканирующего конфокального микроскопа, оснащенного двумя высокочувствительными лавинными фотодиодами (ЛФД).

Первая методика основана на иммобилизации нуклеосом на поверхности стекол и измерении интенсивности  флуоресценции меток  Cy3 и Cy5 в составе одиночных нуклеосом. 


Рис.1. Схема строения нуклеосомы для иммобилизации и изучения методом FRET на уровне единичных нуклеосомных комплексов.

Иммобилизация нуклеосом обеспечивается за счет высокоаффинного взаимодействия между молекулами  стрептавидина на химически модифицированной поверхности стекла и биотина, конъюгированного с нуклеосомальной ДНК (рис. 1). ДНК включает в себя также промотер T7A1 для инициации транскрипции РНК-полимеразой и флуоресцентные метки Cy3 (донор) и Cy5 (акцептор), расположенные в специально подобранных положениях. Эти положения выбраны так, что Cy3 и Cy5 оказываются в соседних витках ДНК на гистоновом коре на расстоянии, обеспечивающем эффективный FRET. Регистрируя изменения величины эффекта FRET в процессе транскрипции РНК-полимеразой, можно изучать структурные изменения, происходящие в нуклеосоме.


Рис. 2. Пространственное  распределение иммобилизованных единичных нуклеосом, измеренное методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии при возбуждении флуоресценции Су3 длиной волны 514 нм. Метка масштаба – 1 мкм.

Нами разработан и оптимизирован протокол химической модификации поверхности стекла, обеспечивающий  иммобилизацию нуклеосом с контролируемой плотностью распределения.



Рис. 3. Флуктуации во времени сигнала Cy3 и Cy5 (вверху) и эффективности FRET отдельной иммобилизованной нуклеосомы (внизу). Стрелкой отмечено фотообесцвечивание Су3 или переход метки в долгоживущее «темное» состояние (т.н. мерцание- blinking).

Благодаря этому оптическая микроскопия с разрешающей способностью ~200 нм оказывается применима для изучения единичных наноразмерных нуклеосом, расположенных на расстояниях более 500 нм друг от друга.  Показано, что, используемая нами, экспериментальная установка обеспечивает возможность регистрации сигнала единичных нуклеосом с отношением сигнал/шум >5 (рис. 2). Снижение содержания кислорода в растворе, достигаемое за счет применения ферментной системы на основе глюкозоксидазы и каталазы, позволяет увеличить в 20 раз фотостабильность флуорофоров и обеспечить возможность длительных кинетических  измерений с разрешением ~800 мс (рис. 3). 

В основе второй методики -  регистрация флуоресценции  нуклеосом, свободно диффундирующих через фокус лазерного луча, с конфокальной фильтрацией сигнала. При этом в любой момент времени в фокусе находится не более одной нуклеосомы. От каждой нуклеосомы, проходящей через фокус,  одновременно измеряется интенсивность флуоресценции, Су3 и Су5 (Рис. 4), что позволяет рассчитать эффективность FRET (E), которая обратно пропорциональна шестой степени расстояния между метками в составе нуклеосомы.    


Рис. 4. Анализ флуктуаций сигнала Cy3 и Cy5, возникающих при прохождении единичных нуклеосом через фокус лазерного луча и определение эффективности FRET  в составе нуклеосомы.

Эффективность FRET рассчитывают по формуле:


(1), где Ia и Iдэто измеряемые интенсивности сигналов Cy3 и Cy5, а γ- поправка на вклад сигнала Су3 в измеряемую интенсивность сигнала Су5.

По результатам анализа сигналов всех зарегистрированных нуклеосом строят  гистограмму распределения нуклеосом по величине FRET (Рис. 5), которая характеризует гетерогенность образца нуклеосом. Изменения в гистограммах распределения нуклеосом отражают структурные перестройки, вызванные различными факторами.


Рис. 5. Гистограмма распределения свободно диффундирующих нуклеосом по величине FRET, измеренная методом лазерной конфокальной микроскопии.

Методика применима для: изучения структуры нуклеосом в стационарных состояниях и медленных (в диапазоне десятков секунд) структурных  изменений; оценки качества сборки нуклеосом; контроля за влиянием иммобилизации на структуру  нуклеосомных комплексов.

Работа выполнена при поддержке гранта №11.G34.31.0009 Минобрнауки.



версия для печати