Главная страница Карта сайта Контактная информация





     


Главная » О лаборатории » Группа мономолекулярной флюоресцентной спектроскопии »

Разработка и оптимизация протокола иммобилизации нуклеосом на покровном стекле

Нами был разработан и оптимизирован протокол иммобилизации единичных биотин-меченных флуоресцирующих молекул, на внутренних поверхностях сборной стеклянной кюветы. Принципиальная схема этого протокола представлена на рисунке 1.


Рисунок 1. Схема протокола иммобилизации нуклеосом на покровном стекле.
1. подготовка покровных стекол к модификации;
2. модификация стекла смесью силан-ПЭГ и силан-ПЭГ-биотин;
3. высокоаффинное связывание стрептавидина с биотином; 4. иммобилизизация биотин-меченных нуклеосом за счет высокоаффинного взаимодействия биотина с иммобилизованным на поверхности стрептавидином (стрептавидин имеет 4 центра связывания биотина).

Оптимизированный протокол иммобилизации биотинилированных флуоресцентно меченных молекул включает в себя следующие процедуры:

1. Подготовка стенок кюветы (покровного и предметного стекол) к модификации

1.1. Очистка покровного и предметного стекла хромовой смесью.
Предметные и покровные стекла помещают в специальную стеклянную камеру, заливают хромовой смесью и выдерживают 30 сек. Хромовую смесь сливают. Промывают кювету бидистиллятом 5-6 раз.
1.2. Гидроксилирование поверхности стекол.
Кювету со стеклами заливают 1 M раствором KOH, инкубируют 1 ч. Щелочь сливают, промывают кювету бидистиллятом.

2. Модификация поверхности стекол силан-ПЭГ и силан-ПЭГ-биотином.

Готовят раствор смеси конъюгатов силан-полиэтиленгликоля (силан-ПЭГ) и силан-ПЭГ-биотина в толуоле. Помещают 40 мкл раствора на центр предметного стекла, накрывают покровным стеклом и инкубируют 1 ч. Стекла разделяют, промывают и сушат при комнатной температуре. Хранят стекла при -20°С. Срок хранения модифицированных стекол без потери функциональных свойств составляет не менее 2 месяцев.

3. Связывание стрептавидина с биотином на поверхности стекла.

После сборки кюветы модифицированные поверхности должны быть ориентированы внутрь кюветы. В кювету вносят 35-40 мкл раствора стрептавидина и выдерживают 10 мин. За это время стрептавидин образует высокоаффинные комплексы с биотином на поверхности стекла.  Связывание стрептавидина  с биотином практически необратимо, т.к. константа диссоциации этих комплексов – 10-14 М. Затем  3-4 раза промывают кювету дистиллированной водой или буфером, чтобы удалить избыток не связавшегося стрептавидина.     

4. Иммобилизизация биотин-меченных молекул (нуклеосом) на поверхности стекла.

В кювету вносят раствор исследуемых биотин-меченных молекул (нуклеосом), которые связываются со стрептавидином на поверхности стекла (стрептавидин имеет 4 высокоаффинных центра связывания биотина). Избыток не связавшихся биотин-меченных молекул (нуклеосом) удаляют, промывая кювету 1-2 раза буферным раствором.  
Процедура модификации стекол занимает не более 3 ч.   Одновременно удается модифицировать около 20 стекол.  Проведены эксперименты, которые показали, что модифицированные стекла не теряют своих функциональных свойств (способность связывать стрептавидин и биотин-меченные молекулы), по меньшей мере, в течение 2 месяцев хранения.



версия для печати