Главная страница Карта сайта Контактная информация





     


Главная » О лаборатории » Группа мономолекулярной флюоресцентной спектроскопии »

Приборная база

Разработку методик регистрации сигнала иммобилизованных одиночных нуклеосомных комплексов проводили с применением уникальной установки на основе сканирующего конфокального микроскопа SP2 с модулем детекции, оборудованным лавинными фотодиодами (SP2-APD фирмы Leica, Рис. 1). Установка была адаптирована для регистрации сигналов одиночных молекул путем замены модулей в 4π-микроскопе сверхвысокого разрешения фирмы Leica, имеющегося в Лаборатории оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул ИБХ РАН, и оптимизации набора оптических фильтров.


Рисунок 1. Внешний вид установки SP2-APD фирмы Leica, используемой для регистрации сигнала единичных молекул, иммобилизованных на внутренних поверхностях специальной сборной стеклянной кюветы.

Оптическая схема установки представлена на рисунке 2. Луч лазера проходит через объектив и фокусируется в заданную точку образца. Испускаемый образцом флуоресцентный сигнал собирается тем же объективом и, пройдя через акустооптическое светоделительное устройство (АОСУ), подвергается пространственной фильтрации с помощью конфокальной диафрагмы. Затем с помощью подвижного зеркала Зм сигнал направляется либо в модуль с детекторами на основе ФЭУ, либо в модуль для детекции слабых сигналов. В первом случае флуоресцентный сигнал разлагается в спектр призмой и с помощью регулируемых щелей с зеркальной поверхностью  разводится по пяти каналам и регистрируется с помощью соответствующих ФЭУ.  Ширина щелей регулируется, и они выполняют функцию фильтров, перестраиваемых по ширине и диапазону длин волн пропускания. Модуль с ФЭУ используется нами для быстрой настройки фокуса на границу раздела раствор-стекло с иммобилизованными молекулами по сигналу светорассеяния.  
Во втором случае дихроичное зеркало делит всю собранную флуоресценцию на два спектральных диапазона. Один спектральный диапазон проходит через дихроичное зеркало, а другой отражается от него. На пути как прошедшей, так и отраженной флуоресценции ставят полосовые фильтры, которые позволяют дополнительно ограничить спектральный диапазон, проходящий на лавинные фотодиоды (ЛФД), используемые в качестве детекторов. Чувствительность ЛФД в красной области спектра намного выше, чем у ФЭУ, а собственные шумы намного ниже. Поэтому именно  ЛФД используют для регистрации слабых сигналов от единичных молекул.


Рисунок 2. Оптическая схема установки SP2-APD фирмы Leica, используемой для регистрации сигнала иммобилизованных единичных молекул.  Луч лазера обозначен сплошной линией. Флуоресценция, излучаемая препаратом в диапазоне длин волн l1 - l8, обозначена прерывистой линией. АОСУ – акустооптическое светоделительное устройство, Л- линза, КД- конфокальная диафрагма, ФЭУ – фотоэлектронный умножитель, З – зеркало, Зм - перемещаемое зеркало, которое позволяет направить сигнал в модуль с детекторами на основе ФЭУ или в модуль для регистрации слабых сигналов, П  -призма, раскладывающая сигнал в спектр, Щ – зеркальная щель регулируемой ширины, ДЗ – дихроичное зеркало, Ф – полосовой фильтр, ЛФД- лавинный фотодиод.  

Для получения двумерных изображений в установке SP2-APD фирмы Leica используются зеркала-сканеры. С помощью системы из двух зеркал-сканеров лазерный луч перемещается от точки к точке в плоскости препарата XY, и  по мере сканирования сигнал с ЛФД преобразуется в компьютере в двумерное изображение, описывающее распределение интенсивности сигнала  в плоскости XY. Роль конфокальной диафрагмы – улучшить разрешение микроскопа вдоль оптической оси объектива (оси Z) и увеличить отношение сигнал/шум. По оси Z образец перемещается с помощью моторизованного предметного столика с точностью около 100 нм. 

Для исследования иммобилизованных молекул и их комплексов нами был отобран 100-кратный маслоиммерсионный объектив категории план апохромат с числовой апертурой 1,46 (Рис. 3). Интенсивность собираемой с помощью объектива флуоресценции пропорциональна второй степени числовой апертуры. Поэтому даже изменение числовой апертуры от 1,3 до 1,46 увеличивает интенсивность собранного сигнала на 26%. Кроме того, в данном объективе предусмотрена возможность коррекции на толщину покровного стекла, что также улучшает эффективность сбора флуоресценции.


Рисунок 3. Для повышения эффективности сбора сигнала флуоресценции от одиночных молекул необходимо использовать иммерсионный объектив с высокой числовой апертурой. В наших экспериментах применялся 100´ маслоиммерсионный объектив категории план-апохромат с числовой апертурой 1,46 и возможностью коррекции на толщину покровного стекла.  

В настоящее время ведутся работы по оптимизации методик измерения одиночных иммобилизованных молекул и их комплексов с использованием нового лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM710-Confocor3 фирмы Zeiss, приобретенного Биологическим факультетом МГУ при поддержке Программы развития Московского Университета (Рис. 4).    

 




Рисунок 4. Внешний вид установки LSM710-Confocor3 фирмы Zeiss для изучения структуры и функционирования одиночных супрамолекулярных комплексов (Программа развития Московского Университета). 

Разработку методик исследования одиночных флуоресцирующих нуклеосом, свободно диффундирующих в растворе,  проводили с применением экспериментальной установки LSM510-Confocor2 (Zeiss, Германия, Рис. 5). Принцип этой методики и особенности устройства установки LSM510-Confocor2 следующие.





Рисунок 5. Внешний вид и схема экспериментальной установки LSM510-Confocor2 (Zeiss, Германия) для исследования одиночных молекул, свободно диффундирующих в растворе, методом лазерной конфокальной микроскопии. ДЗ – дихроичное зеркало, З – зеркало, ЛФД- лавинный фотодиод.

Луч лазера с длиной волны 514,5 нм фокусируется объективом инвертированного микроскопа в точку внутри кюветы с раствором нуклеосом на расстоянии порядка 100 мкм от тонкого (130-170 мкм) плоского стеклянного дна кюветы. Для этого используется 40-кратный водо-иммерсионный объектив C-Apochromat с числовой апертурой 1,2. Положение фокуса лазера фиксировано и не меняется во времени.  Испускаемый образцом флуоресцентный сигнал собирается тем же объективом и направляется в модуль с высокочувствительными детекторами на основе лавинных фотодиодов (ЛФД). В этом модуле весь собранный сигнал разделяется дихроичным зеркалом (ДЗ4, граница пропускания/отражения - 610 нм) на два спектральных диапазона, соответствующих флуоресценции Су3 и Су5. Разделенные сигналы фильтруются полосовым фильтром 530-600 нм (сигнал Су3) и длинноволновым барьерным фильтром с границей 650 нм (сигнал Су5 с небольшим вкладом сигнала Су3), которые позволяют дополнительно ограничить спектральные диапазоны, проходящие к ЛФД.  Спектрально разделенные сигналы подвергаются пространственной фильтрации с помощью конфокальных диафрагм, установленных перед обоими ЛФД. Как результат на ЛФД попадает спектрально выделенный сигнал, испускаемый одиночными молекулами при прохождении их через фокус лазерного луча. Объем, из которого регистрируется сигнал, имеет форму эллипсоида с размерами главных осей около 0,25 и 1,25 мкм.

К настоящему времени методики исследования одиночных нуклеосом, свободно диффундирующих в растворе, успешно адаптированы для применения  с использованием нового лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM710-Confocor3 фирмы Zeiss, приобретенного Биологическим факультетом МГУ при поддержке Программы развития Московского Университета (Рис. 4). Микроскоп LSM710-Confocor3 позволил существенно улучшить отношение сигнал/шум и временное разрешение при измерении сигнала от одиночных диффундирующих молекул по сравнению с микроскопом LSM510-Confocor2. 



версия для печати